一種單管RAA-CRISPR-Cas12a診斷平臺(tái)，用于快速檢測(cè)沙眼衣原體
沙眼衣原體作為全球高發(fā)的性傳播病原體及可預(yù)防性致盲的主要病因，對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，可引發(fā)泌尿生殖道感染、沙眼及新生兒結(jié)膜炎等多種疾病。而傳統(tǒng)檢測(cè)方法依賴實(shí)驗(yàn)室設(shè)備、操作繁瑣且耗時(shí)較長(zhǎng)，難以滿足基層及現(xiàn)場(chǎng)快速篩查的需求。
蘇州大學(xué)附屬南京中醫(yī)藥大學(xué)蘇州醫(yī)院、昆明醫(yī)科大學(xué)延安醫(yī)院等機(jī)構(gòu)的研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種集成的單管RAA-CRISPR-Cas12a診斷平臺(tái)，用于沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis, CT）的快速、超靈敏和可視化檢測(cè)。該平臺(tái)結(jié)合了快速核酸裂解、等溫?cái)U(kuò)增和CRISPR-Cas12a切割技術(shù)，并配套便攜式掌上熒光檢測(cè)儀和終端應(yīng)用程序，旨在滿足即時(shí)檢測(cè)（POCT）的需求。
1.靶標(biāo)基因：針對(duì)沙眼衣原體高度保守的基因組區(qū)域設(shè)計(jì)引物和向?qū)NA。
2.單管集成反應(yīng)：采用創(chuàng)新的“管中管”結(jié)構(gòu)，將重組酶輔助擴(kuò)增（RAA）反應(yīng)體系與CRISPR-Cas12a檢測(cè)體系物理分隔在同一反應(yīng)容器內(nèi)。
第一步（39°C，20分鐘）：位于內(nèi)管的RAA體系對(duì)目標(biāo)核酸進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增。
第二步（混合后，39°C，5分鐘）：使用穿刺棒刺破內(nèi)管底部，通過(guò)離心混合RAA擴(kuò)增產(chǎn)物與位于外管的CRISPR-Cas12a檢測(cè)試劑。Cas12a在crRNA引導(dǎo)下識(shí)別靶標(biāo)DNA，激活其反式切割活性，切割單鏈DNA熒光報(bào)告探針（FAM標(biāo)記），釋放熒光信號(hào)。
3.信號(hào)讀取：通過(guò)配套的便攜式4通道熒光檢測(cè)儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光動(dòng)力學(xué)曲線，結(jié)果可通過(guò)連接的終端應(yīng)用程序進(jìn)行可視化判讀。也可通過(guò)更換為生物素標(biāo)記的探針，使用側(cè)流層析試紙條進(jìn)行結(jié)果判讀。
其中，使用了沃博生物（warbio）RPA技術(shù)與相關(guān)試劑，CRISPR Cas12/13 HybriDetect試紙條,貨號(hào)JY0301。
1.引物與crRNA篩選：設(shè)計(jì)了4對(duì)RAA引物，通過(guò)凝膠電泳篩選出最優(yōu)引物對(duì)（F1R1）。針對(duì)RAA擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)的PAM位點(diǎn)（TTTN），設(shè)計(jì)了沙眼衣原體特異性的crRNA。
RAA反應(yīng)體積：確定10 μL為最佳反應(yīng)體積。
CRISPR-Cas12a反應(yīng)體系：優(yōu)化后確定Cas12a蛋白濃度為250 nM，crRNA濃度為200 nM時(shí)，切割效率最佳。
單管結(jié)構(gòu)：優(yōu)化后采用RAA體系15.5 μL，CRISPR體系40 μL的“管中管”設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)了理想的檢測(cè)性能。
1.靈敏度：對(duì)沙眼衣原體質(zhì)粒DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋檢測(cè)。該單管平臺(tái)的檢測(cè)限為10¹ 拷貝/mL。作為對(duì)比，實(shí)驗(yàn)中使用的qPCR方法的檢測(cè)限為10² 拷貝/mL，表明該平臺(tái)具有與qPCR相當(dāng)甚至更優(yōu)的靈敏度。
2.特異性：使用其他常見(jiàn)生殖道病原體（淋病奈瑟菌、解脲脲原體、白色念珠菌、陰道毛滴蟲、陰道加德納菌等）的DNA進(jìn)行交叉反應(yīng)測(cè)試。結(jié)果顯示，僅沙眼衣原體樣本產(chǎn)生陽(yáng)性信號(hào)，與其他所有測(cè)試病原體均無(wú)交叉反應(yīng)，證明了方法的高特異性。
使用87份臨床陰道/宮頸拭子樣本（殘留樣本）進(jìn)行驗(yàn)證。
以qPCR作為參考方法（檢出28例陽(yáng)性，59例陰性）。
本平臺(tái)檢出29例陽(yáng)性，58例陰性。
靈敏度：100.00% (95% CI: 87.66–100.00%)
特異性：98.31% (95% CI: 90.91–99.96)
總符合率：98.85% (95% CI: 93.76–99.97)
陽(yáng)性預(yù)測(cè)值：96.55% (95% CI: 80.04–99.49)
陰性預(yù)測(cè)值：100.00% (95% CI: 93.84–100.00%)
結(jié)果表明，該平臺(tái)與qPCR結(jié)果高度一致，即使在qPCR Ct值較高的樣本中，也能觀察到明顯的熒光曲線上升。
04、方法優(yōu)勢(shì)與創(chuàng)新點(diǎn)
1.真正的單管封閉系統(tǒng)：創(chuàng)新的“管中管”設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)了RAA擴(kuò)增與CRISPR檢測(cè)在同一密閉管內(nèi)的時(shí)空分離與混合，極大降低了氣溶膠污染風(fēng)險(xiǎn)，簡(jiǎn)化了操作流程。
2.高靈敏度與特異性：結(jié)合了RAA的高效擴(kuò)增和CRISPR-Cas12a的高特異性識(shí)別與信號(hào)放大，檢測(cè)限低至10¹ 拷貝/mL，且無(wú)交叉反應(yīng)。
3.快速便攜：整個(gè)檢測(cè)流程（包括5分鐘核酸快速釋放、20分鐘RAA擴(kuò)增和5分鐘CRISPR切割）可在約30分鐘內(nèi)完成。配套的掌上熒光檢測(cè)儀小巧便攜，無(wú)需復(fù)雜溫控程序，適合現(xiàn)場(chǎng)和基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)使用。
4.“基礎(chǔ)RAA + CRISPR”策略優(yōu)勢(shì)：與需要復(fù)雜探針設(shè)計(jì)的等溫?cái)U(kuò)增直接檢測(cè)方法相比，該方法使用基礎(chǔ)RAA引物進(jìn)行擴(kuò)增，依靠CRISPR-Cas12a實(shí)現(xiàn)特異性識(shí)別和信號(hào)轉(zhuǎn)換，避免了非特異性信號(hào)，提高了檢測(cè)的可靠性。
5.雙模式讀取：兼容實(shí)時(shí)熒光定量和側(cè)流層析試紙條可視化讀取，應(yīng)用場(chǎng)景靈活。
本研究成功構(gòu)建了一種基于單管RAA-CRISPR-Cas12a的沙眼衣原體快速、超靈敏、特異性檢測(cè)平臺(tái)。臨床驗(yàn)證表明其性能與qPCR高度一致，為沙眼衣原體感染的早期診斷和現(xiàn)場(chǎng)篩查提供了一種強(qiáng)有力的新型技術(shù)手段。
原文鏈接：https://doi.org/10.1186/s13036-025-00591-z
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貨號(hào)
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產(chǎn)品
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規(guī)格
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TABAS03KIT
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TwistAmp Basic Kit DNA擴(kuò)增試劑盒
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TAEXO02KIT
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TwistAmp exo 試劑盒
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96T
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B8201C1
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DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（DNA基礎(chǔ)型）
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48T
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B8202C3
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DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（DNA熒光型）
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48T
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B8203C5
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DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（DNA試紙條型）
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48T
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B8204C7
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RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（RNA基礎(chǔ)型）
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48T
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B8205C9
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RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（RNA熒光型）
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48T
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B8206C0
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RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（RNA試紙條型）
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48T
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JY0209
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雙靶標(biāo)HybriDetect側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l（彩虹型）
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JY0201
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單靶標(biāo)HybriDetect側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l（彩虹型）
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JY0307
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CRISPR單酶切及擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)試紙條
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50T
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JY0301
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CRISPR Cas12/13 HybriDetect試紙條
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50T
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JY0308
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CRISPR雙酶切檢測(cè)試紙條（變色龍）
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50T
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